研究背景

在骨缺損修復(fù)過程中，受損部位會經(jīng)歷細(xì)胞募集、血管重建和新骨形成等一系列生物學(xué)過程。生物活性玻璃(bioactive glass, BG) 是一類能釋放功能性離子、參與血管生成與成骨過程的生物材料，可通過釋放功能性離子在血管生成與成骨過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。銅摻雜生物活性玻璃(CuBG) 能釋放包括Cu²⁺、Ca²⁺和SiO?^4-在內(nèi)的多種離子，這些離子對組織再生具有促進(jìn)作用。其中，Cu²⁺通過抑制缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α) 在細(xì)胞核內(nèi)與核外的降解來模擬缺氧效應(yīng)，從而激活HIF-1信號通路，進(jìn)一步上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS) 的表達(dá)，增強(qiáng)血管生成能力。此外，CuBG還能激活多種成骨相關(guān)信號通路，如MAPK、Wnt/β-連環(huán)蛋白和BMP-Smad通路等，富集細(xì)胞內(nèi)成骨相關(guān)的miRNA，協(xié)同促進(jìn)骨缺損修復(fù)。然而，在早期階段，離子的快速釋放會導(dǎo)致離子濃度升高和堿性增強(qiáng)，從而引發(fā)劇烈疼痛、溶血反應(yīng)及過度炎癥反應(yīng)，最終阻礙骨再生進(jìn)程。

源自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs) 的小型胞外囊泡(sEVs) 被認(rèn)為是一種安全有效的生物制劑，這些囊泡可被遠(yuǎn)端細(xì)胞攝取，并顯著調(diào)節(jié)其功能與行為。sEVs不僅能夠保留源細(xì)胞的優(yōu)勢特性，還能避免其潛在缺陷；同時其分子信號具有歸巢效應(yīng)、循環(huán)穩(wěn)定性以及非免疫原性等特點(diǎn)，可有效募集細(xì)胞并促進(jìn)組織修復(fù)。然而，在骨缺損條件下，BMSCs來源的sEVs存在產(chǎn)量有限、促血管生成與成骨能力不足等問題，嚴(yán)重限制了其在臨床治療中的應(yīng)用。

本研究采用CuBG處理BMSCs，制備出小型胞外囊泡(sEVs)，并將其類比為“納米振動激發(fā)器"(nano-vibration exciter)。通過激活HIF-1信號通路及其介導(dǎo)的自噬過程，將CuBG釋放的離子信號轉(zhuǎn)化為生化因子信號，從而更高效地發(fā)揮BG的成骨潛能，驅(qū)動組織的再生與修復(fù)。

1.sEVs的提取和表征

BG(60SiO₂-36CaO-4P₂O₅) 和CuBG(60SiO₂-34CaO-2CuO-4P₂O₅) 納米顆粒均呈現(xiàn)球形結(jié)構(gòu)，具有非晶相結(jié)構(gòu)特征，平均粒徑分別為467.31 nm和307.48 nm。CuBG具有良好的生物相容性，在作用于BMSCs后未引起sEVs粒徑或形態(tài)的顯著改變，避免了傳統(tǒng)缺氧培養(yǎng)方法可能引發(fā)的細(xì)胞凋亡等副作用。CuBG釋放的Cu²⁺通過抑制細(xì)胞核外羥化酶(PHD) 對脯氨酸殘基的羥化作用，阻斷細(xì)胞核內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子抑制因子1(FIH-1) 的活性，從而抑制HIF-1α的降解，穩(wěn)定HIF-1α蛋白。

2.CuBG-sEVs增強(qiáng)成骨活性的機(jī)制

CuBG能釋放Cu²⁺、Ca²⁺和SiO?^4-等多種促進(jìn)組織再生的離子，其中，Cu²⁺通過抑制HIF-1α在細(xì)胞核內(nèi)和核外的降解過程來模擬缺氧效應(yīng)，從而激活HIF-1信號通路，并上調(diào)促血管生成miRNA的表達(dá)，特別是miR-210。在缺氧條件下，HIF-1α?xí)M(jìn)入細(xì)胞核，激活自噬相關(guān)基因，如微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3) 和beclin1，并誘導(dǎo)p62蛋白表達(dá)，從而調(diào)控自噬進(jìn)程并增強(qiáng)sEVs的生成。此外，CuBG釋放的Ca²⁺和SiO?^4-等其他活性離子，也能夠促進(jìn)成骨相關(guān)miRNA的富集，如miR-218、miR-146a和miR-21。綜上所述，CuBG以HIF-1信號通路及其介導(dǎo)的自噬激活作為核心調(diào)控機(jī)制，有效提升了CuBG-sEVs的產(chǎn)量并增強(qiáng)其成骨活性。

3.體外血管生成與骨形成

血管生成在骨形成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，能夠輸送組織再生必需的營養(yǎng)素、礦物質(zhì)、生長因子和氧氣。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs) 能夠有效攝取sEVs，進(jìn)而促進(jìn)血管的生成。CuBG-sEVs可被HUVECs有效內(nèi)化，并顯著刺激其遷移能力，顯示出在細(xì)胞間通訊的重要潛力。此外，CuBG-sEVs表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞募集能力，這可能與其上調(diào)miR-210表達(dá)水平有關(guān)。在miR-210調(diào)控的HIF-1α信號通路激活后，可促進(jìn)VEGF的釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)趨化因子SDF-1的表達(dá)，最終增強(qiáng)細(xì)胞募集過程。

此外，CuBG-sEVs能夠有效上調(diào)包括VEGF、激酶插入結(jié)構(gòu)域受體(KDR)、eNOS以及血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(CD31) 在內(nèi)的多個血管生成關(guān)鍵基因的表達(dá)。在該調(diào)控作用下，細(xì)胞間連接性顯著增強(qiáng)，并形成了典型的管狀結(jié)構(gòu)，新生血管數(shù)量與血管長度顯著增加，充分證明了CuBG-sEVs在促進(jìn)血管生成方面的顯著效能。

原代間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs) 的募集及其成骨分化在骨再生過程中具有關(guān)鍵作用。CuBG-sEVs富含多種與成骨相關(guān)的miRNA，如miR-218、miR-146a和miR-21，表現(xiàn)出顯著的成骨潛力。經(jīng)CuBG-sEVs處理后，多個成骨相關(guān)基因的表達(dá)均顯著上調(diào)，包括堿性磷酸酶(ALP)、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(RUNX2)、骨鈣素(OCN)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2) 和I型膠原α1(COL1A1) 等。其中，ALP和RUNX2的上調(diào)在骨基質(zhì)合成與礦化初期階段起著關(guān)鍵作用，而礦化基質(zhì)含量的增加進(jìn)一步促進(jìn)了成骨進(jìn)程。

CuBG-sEVs中的miRNA不僅可以通過調(diào)控Wnt/β-連環(huán)蛋白、PI3K/Akt和MAPK信號通路誘導(dǎo)BMSCs向成骨分化，更能精準(zhǔn)靶向調(diào)控該過程的關(guān)鍵靶點(diǎn)，這種多層面的調(diào)控機(jī)制，充分印證了CuBG-sEVs作為CuBG優(yōu)質(zhì)替代品的應(yīng)用價值。

4.體內(nèi)血管生成與骨形成

作為遞送載體使用的單寧酸包被明膠甲基丙烯酰基冷凍凝膠(TG)，展現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性、機(jī)械性能和大孔結(jié)構(gòu)?；谶@些特性，它能高效吸附自噬體，并能實(shí)現(xiàn)對藥物釋放動力學(xué)的精準(zhǔn)調(diào)控。

通過在大鼠顱骨臨界缺損模型中的評估證實(shí)，CuBG-sEVs/TG能更有效地促進(jìn)新骨形成。其療效具體表現(xiàn)為骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th) 的同步顯著增加，凸顯了CuBG-sEVs/TG在骨修復(fù)面積與骨再生質(zhì)量兩方面的全面優(yōu)勢。

CuBG-sEVs/TG引發(fā)了有序的骨愈合過程：缺損區(qū)快速形成連續(xù)新骨并向中心延伸，同時伴隨細(xì)胞外基質(zhì)的顯著沉積與膠原纖維的致密化、成熟化。這充分證明了高活性CuBG-sEVs的持續(xù)釋放能高效促成高質(zhì)量骨再生。

CuBG-sEVs通過miR-210調(diào)控KDR/VEGF/eNOS信號軸，顯著上調(diào)了血管關(guān)鍵蛋白CD31的表達(dá)，從而驅(qū)動HUVECs的粘附與聚集，有效促進(jìn)了血管生成。所形成的血管網(wǎng)絡(luò)為骨再生提供了必要的營養(yǎng)支持，其與成骨過程在時空上的高度耦合，表明CuBG-sEVs/TG通過促血管生成為成骨奠定了堅(jiān)實(shí)的微環(huán)境基礎(chǔ)。

CuBG-sEVs通過其中的miRNA(如miR-218、miR-146a和miR-21) 上調(diào)OCN表達(dá)以激活與成骨相關(guān)的信號通路；同時，引導(dǎo)骨基質(zhì)的關(guān)鍵成分I型膠原形成有序、與內(nèi)源性新骨強(qiáng)互聯(lián)的結(jié)構(gòu)框架，有效支持細(xì)胞遷移、定植及新骨的支持和保護(hù)。這兩方面協(xié)同作用，共同強(qiáng)化了骨再生過程。

本研究開發(fā)了的納米振動激發(fā)器CuBG-sEVs，通過HIF-1信號通路將CuBG的離子信號高效轉(zhuǎn)化為miRNA信號，激活自噬過程，顯著提升CuBG-sEVs產(chǎn)量。由此產(chǎn)生的CuBG-sEVs能被HUVECs和BMSCs快速內(nèi)化，通過富集的miRNA發(fā)揮招募細(xì)胞、促進(jìn)血管生成與成骨分化的雙重效應(yīng)。

此外，將CuBG-sEVs與TG冷凍凝膠聯(lián)合應(yīng)用于骨缺損部位，CuBG-sEVs通過驅(qū)動細(xì)胞募集、血管生成與成骨分化這一核心機(jī)制，有效支持骨缺損的全面再生；該過程伴隨著加速血管生成與增強(qiáng)I型膠原沉積，從而顯著提高了修復(fù)效率。此項(xiàng)工作證實(shí)了sEVs作為BG替代方案的巨大潛力，為提升骨再生療效提供了新思路。